行业研究-免疫组化
免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
目录
基本原理
抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。
免疫组化方法分类
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自显影法等。这些常用免疫组织化学方法的原理如下：
- 免疫荧光细胞化学技术：将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光,从而可以确定组织中的抗原定位或定量。
- 免疫酶细胞化学技术：是目前免疫组织化学研究中最常用的技术．基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究。
- 免疫胶体金技术：就是用胶体金标记一抗，二抗或其他的能特异性的结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针对组织或细胞内的抗原进行定性，定位或定量研究．由于胶体金的电子密度高，多用于免疫电镜的单标记或多标记的定位研究。
免疫组织化学基本过程
免疫组织化学的全过程包括：
- 抗原的提取与纯化；
- 免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体（免疫球蛋白）以及抗体的纯化；
- 将显色剂与抗体结合形成标记抗体；
- 标本的制备；
- 免疫细胞化学反应以及呈色反应；
- 观察结果。
免疫组织化学应用的基本原则
免疫组织化学染色在生物医学研究中具有十分广泛的作用。并且涉及许多研究领域。但是，免疫组织化学技术也有其局限性，例如，组织细胞内的待测物质要有抗原性，而且需要有一定浓度方可检出；检出的免疫反应阳性蛋白不能被确定是细胞新合成的蛋白还是通过细胞间运输而来的蛋白，因此，在实验设计中应充分考虑这些特点。如果实验需要证明已知蛋白为何种细胞合成，需采用分子原位杂交技术解决。为引导初学者在实验设计中合理巧妙地运用免疫组织化学技术，将其应用的基本原则简述如下：
- 确定细胞类型和形态。组织细胞内有些蛋白具有组织特异性，如胶质原纤维酸性蛋白（gial fibrillary acidic protein，GFAP）只存在于星形胶质细胞内．神经丝蛋白（Neurofilament，NF）只存在于神经细胞内。通常把这些具有组织特异性的蛋白称为标记性蛋白（Proteiniliaker）。通过标记性蛋白的特异性抗体可确定细胞种类。有些细胞（如表皮内朗格汉斯细胞和黑色素细胞等）在光镜下不易辨认，通过对胞质内的特定蛋白实施免疫组化染色，便能清楚显示此类细胞外形轮廓。这种作用在神经科学研究和肿瘤临床病理中显得尤为重要。
- 辨认细胞产物的来源。利用某些细胞产物为抗原，制备相应的抗体，对组织细胞实施免疫组织化学染色，以确定细胞产物的来源。如内分泌细胞产生的各种激素，大多数可用免疫组化染色技术辨认，据此可研究细胞的分泌功能及对内分泌肿瘤作功能分类，检测分泌异位激素的肿瘤等，了解细胞分化程度。
免疫组织化学染色法（DAB显色）
- 确定细胞的分化程度分化程度。不同的同一类细胞多表达不同的标志性蛋白，根据对这些不同蛋白的鉴定可确定细胞的分化程度。例如，神经上皮细胞的标志性蛋白是巢蛋白（nestin），当其分化为放射状胶质细胞时表达波形蛋白（vimentin）。在神经元发生期分化为成神经细胞时则表达Ⅲβ神经微管蛋白（TUJl），成神经细胞分化为成熟的神经元时表达神经丝蛋白（neurofilament，NF）。
- 追踪神经纤维束和它的投射区。用于此目的的免疫组织化学方法常与轴浆运输示踪法相结合来研究神经元之间的联系。轴浆运输示踪法是利用某些物质可被神经末梢摄取。经轴质逆行运输到胞体的特点．用组织化学方法显示出神经元的轮廓。常用示踪剂有辣根过氧化物酶和荧光金等。例如。为观察周围神经系统或中枢神经系统某核团神经纤维投射．先将示踪剂注射到动物神经纤维末梢部位，使动物存活一段时间，在预期神经纤维投射部位取材，先通过组织化学方法使示踪剂定位，再实施免疫组织化学方法确定其性质。
- 在临床病理中的应用。如鉴定病变性质，发现微小病灶，探讨肿瘤起源或分化表型，确定肿瘤分期，指导治疗和预后。辅助疾病诊断和分类，寻找感染病因等。
免疫组化实验所用的抗体
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本
实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片的抗原修复及方法
石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
